高效液相色谱法HPLC

高效液相色谱法（HPLC）是一种利用液体作为流动相，通过高压输液系统、高效固定相和高灵敏度检测器对复杂样品进行分离分析的色谱技术。

其中，化学键合相色谱法是一种以化学键合相（通过化学反应将有机基团键合在载体表面）为固定相的方法。

①正相键合相色谱法：使用极性键合相（如氰基、氨基键合在硅胶表面）作为固定相，以非极性或弱极性溶剂（如烷烃加适量醇类）作为流动相。主要用于分离溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物。

②反向键合相色谱法：使用非极性键合相（如十八烷基硅烷、辛烷基硅烷）作为固定相，流动相为水加一定量极性调整剂（如乙醇-水、乙腈-水）。同系物中，含碳数越多，极性越弱，k越大。流动相pH值改变会影响组分理解成度，其他条件不变时，组分离解程度越高，tR越小。常加入弱酸、弱碱、缓冲溶液调节流动相pH，又称离子色谱抑制法，适用于3≤pKa≤7弱酸及7≤pKa≤8的弱碱。对于弱酸流动相pH降低k增大tR增大，弱碱相反。键合烷基的极性随碳链延长而减弱。

③反向离子对色谱法：试样离子在流动相中与离子对试剂离解出的反离子生成中性离子对，在非极性固定相上产生保留。分析酸类或带负电物质时一般用季铵盐作离子对试剂，常用四丁基季铵盐。分析碱类或带正电物质，一般用烷基磺酸盐或硫酸盐作离子对试剂。离子对碳链长度增加，组分k增大。离子对色谱法适用于有机酸、碱、盐的分离，以及离子交换色谱法无法分离的离子型和非离子型化合物混合物的分离。

键合相特点：①化学稳定性好，使用过程不易流失，柱寿命长；②均一性和重现性好；③柱效高，分离选择性高；④适于梯度洗脱；⑤载样量大。

注意：使用硅胶基质化学键合相，流动相水相pH应维持在2-8。

高效液相色谱速率理论包括涡流扩散、纵向扩散和传质阻抗。HPLC实验条件包括采用小粒径、粒度分布均匀的属性化学键合相，采用低黏度流动相，流速不宜快一般1ml/min，柱温一般25-30℃。

高效液相色谱仪包括高压输液系统、进样系统、色谱柱分离系统、检测系统和数据记录处理及计算机控制系统。

定性分析方法包括色谱鉴定法、化学鉴定法和色谱-光谱联用鉴定法。定量分析方法包括外标法、内标法和主成分对照法。

色谱系统适用性试验包括理论塔板数、分离度、拖尾因子和重复性。