常用的蛹虫草菌种保藏方法有哪些？

在实践中，人们尝试了许多保藏方法，如继代培养保藏法、液体石蜡保藏法、蒸馏水保藏法、冷冻干燥保藏法。这些方法各有利弊，在实践中要根据保藏的目的、资金及设备状况等因素，选择最佳保藏方法。

1.斜面培养基冰箱保藏法这是最常用的菌种保藏方法。因为它简单易行，不需特殊设备，并能随时观察保藏菌种的情况。因此，短时间保藏菌种，一般都采用此法。

将需要保藏的菌种接种在斜面培养基上，在适宜的温度下培养，当菌丝健壮地长满斜面时，即可将此试管菌种取出，放在4℃的冰箱中保藏。用于保藏菌种的棉塞，要用硫酸纸包扎，防止霉菌污染。冰箱保藏蛹虫草菌种，一般1个月转管一次。

冰箱保藏，虽然简单易行，但温度不够低，只有4℃左右，蛹虫草的新陈代谢活动并未停止，而试管斜面也易失水变干。因此，保藏时间较短，1个月就需转管一次，转管次数多了，变异的可能性也就增大，不适宜长期保藏菌种。若保藏时间超过1月，菌种的转色与出草能力明显下降。

2.大米培养基冰箱保藏蛹虫草在大米培养基上培养后在冰箱内能保藏较长的时间，根据试验，保藏5个月菌种质量无明显变化。

3.蚕蛹基质保藏法以家蚕蛹为培养基保藏蛹虫草，在冰箱保藏4个月或在室温下保藏1个月，均未发现明显的变化，生产上多采用此种方法。

采用大米及家蚕蛹培养基在三角瓶保藏菌种，保藏的菌丝体相对较多，基质不易干燥，生产上使用方便。

4.矿油保藏法矿油（主要是液体石蜡）保藏，也称液体石蜡保藏。此法简单易行，无需另添设备，各生产单位均可应用。矿油能隔绝气体交流，防止培养基水分蒸发，抑制微生物代谢，推迟细胞衰老，能延长微生物的生命。

（1）培养基常用的培养基配方为20%的马铃薯汁500ml，5%的蚕蛹汁500ml，蛋白胨5g，磷酸二氢钾（KH2PO4）3g，硫酸镁（MgSO4H2O）1.5g，葡萄糖20g，维生素B1微量，琼脂15g，pH6.5，1kg/cm2灭菌30min。

（2）矿油处理选用化学纯的液体石蜡（要求不含水、不霉变、比重为0.865～0.890），分装于三角瓶中，装至瓶体的1/3处，塞好棉塞；另配一套具有虹吸管的橡皮塞，用纸包好，与三角瓶一起于1kg/cm2灭菌30min。灭菌后，将液体石蜡放在40℃的温箱中，使液体石蜡中的水分蒸发干净，至石蜡液呈完全透明为止。

（3）接种培养将需保藏的菌种，接入斜面培养基上，在20℃左右下培养，待斜面长满健壮菌丝后，取出装入矿油。

（4）矿油灌注将上述菌种和无菌矿油放入无菌室（箱），把有虹吸管的橡皮塞装上矿油三角瓶，无菌操作使矿油注入斜面试管内（少量菌种也可用无菌吸管灌注），使液面高出斜面顶部1cm。

（5）菌种保藏将灌注矿油的试管直立放在试管架上，于室温或冰箱中保藏均可。室温保藏的环境应注意通风干燥，以免棉塞发霉，并要定期检查。如矿油覆盖的斜面明显变浅，应及时补充无菌矿油，切忌培养基露出液面。

液体石蜡易燃，使用时需加注意。从覆盖矿油斜面中移植菌种时，应尽量少带矿油。因矿油在火焰灭菌时，会爆炸飞溅。

以后用作菌种时，可从斜面上挑取少许培养基，接种在新鲜的培养基上，经过培养，即可使用。

5.双重橡皮栓法用普通的斜面培养基先培养菌丝，用双重橡皮栓取代棉塞。这种双重橡皮栓要预先用氧化丙烯灭菌，方法是按1L容器注入1ml氧化丙烯，原封放置待用。采用蒸汽容易使橡皮变软，而用氧化丙烯等灭菌方法可以避免此弊，利用双重橡皮栓能防止空气进入试管，从而达到与液体石蜡同样的效果。

6.水箱中保藏法把蛹虫草菌种悬浮在不含有机营养成分的水管中保存，一般用的悬浮液有蒸馏水、食盐水、用蒸馏水时，在接有蛹虫草菌种的琼脂培养物中加入6～7ml蒸馏水，使细胞、孢子或蛹虫草菌丝充分悬浮，尔后转入试管内，密封后室温下保藏。用食盐水时，把在琼脂培养基斜面上长好的菌丝悬浮在1%的食盐水中，密封后在室温条件下保存。

7.液氮超低温保藏法此法是将菌种密封在含保护剂的安瓿管内，经控制速度冻结后，在－150～－196℃液态氮超低温罐中保藏。

（1）菌种制备保藏孢子时，取孢子制成悬液，加入保护剂，装入无菌安瓿管内。保藏菌丝体时，用液体振荡法培养菌丝球，或用平板培养菌丝体，也可用麦粒菌种。取适量放入无菌的装有保护剂的安瓿管内。

（2）安瓿管制作安瓿管的玻璃，要能经受温度突变而不破裂，容易用火焰封管口，恢复培养时容易打开。一般采用硼硅玻璃，管的大小根据需要而定，通常是75mm0mm或能容1.2ml液体的安瓿瓶比较合适。选好安瓿管后，每管加进0.8ml保护剂，塞上棉塞，1kg/cm2灭菌15min，作冻结琼脂菌丝片或麦粒菌种用。如冻结孢子悬液时，则空管灭菌。

（3）保护剂用10%（体积比）甘油蒸馏水溶液或10%二甲亚砜（dimethylsulfoxide）蒸馏水溶液作保护剂。

（4）冻结保藏将上述准备好的菌种无菌操作移入加有保护剂的安瓿管中，用火焰将安瓿管上部熔封，浸在水中检查有无漏气。然后将封口的安瓿管放在慢速冻结器内，控制冻结速度（每分钟下降1℃），使样品逐步均匀地冻结到－35℃。－35℃以下的冻结速度，可不用控制而迅速下降。安瓿管冻结后，立即放入液氮罐中。罐内的气相温度为－150℃，液体温度－196℃。

（5）恢复培养保藏菌种时，将安瓿管从液氮罐中取出，立即放入38～40℃的水中摇荡至管内冻结物全部融解，开启安瓿管，将管内菌种接入适宜培养基培养即可。

液氮超低温保藏，是目前长期保藏菌种的最好的一种方法。用它进行保藏各类微生物和活细胞的试验，都获得了满意的结果。对那些难以保藏的或只产生菌丝的真菌，用此法保藏也很成功。

现在，普遍对液氮保藏的效果都持乐观态度，认为液氮保种很少或不会引起细胞中遗传物质的变化。而且液氮保藏后菌株出现的问题却很少报道。然而，Fritssdu首先在荷兰Horst发现杂交菌株U1经液氮保藏3年后出现退化，部分培养物产量下降，出现硬开伞，经组织分离培养后，产量质量又恢复正常。据她认为，经原生质体重新融合产生的杂交菌株，其本身对不利因素（如超低温的刺激）适应性差，故在液氮保藏中必须考虑到这一影响。而且反复的冷冻和解冻也会使菌株受到不同程度的损伤。

另一方面，液氮保藏本身也有不足之处，问题在于液氮保藏系统成本高，有些地方液氮不足，使一般保藏中心不能单独依靠这一保藏技术。而且液氮保藏的菌种，首先必须培养在琼脂培养基或液体培养基中，对邮寄交流造成一定麻烦。

一般认为，在未经有效可靠检测之前，从液氮保藏中取出的菌种尤其是杂交菌株，不宜作当年产季的生产用种，必须经过出菇试验，以确保无退化或无变异才能投入生产。

干燥保藏的作用原理在于除去蛹虫草菌丝细胞的游离水，以达到除去细胞代谢的液相环境，从而使代谢活动停滞并进入休眠状态，有利于长期保存。