【DNA克隆原创系列一】DNA克隆常用方法

本期主要为大家介绍DNA克隆方法的相关内容。

DNA克隆的方法包括T4连接酶介导的DNA克隆、EASY克隆、无缝拼接克隆等，下面将详细介绍这些方法。

一、T4连接酶介导的DNA克隆

传统的分子克隆方法需要使用相同的限制性内切酶酶切载体和目的片段，形成粘性或平末端，使用T4 DNA连接酶进行连接，转化，挑取阳性克隆，获得重组质粒。

为了方便DNA克隆，T载体简化了克隆载体，无需酶切，直接连接片段到载体上，用于DNA保存及后续扩增。

TA克隆为例介绍连接过程。连接是一个三分子共同反应的过程，载体、片段和连接酶碰撞完成连接。过量的DNA和连接酶导致分子间相互作用促进串联体和载体自连，降低片段和酶的利用率。TA克隆时，DNA和酶的量并非越多越好。

T4连接酶介导的克隆适用于连接平末端DNA片段，可通过Taq酶完成加A尾反应。

二、EASY克隆

EASY克隆方法依赖于载体上携带的拓扑异构酶，该酶在DNA复制过程中具有内切酶和连接酶的功能，通过识别特定序列进行切割和连接。拓扑异构酶的发现使得克隆成为可能。

EASY克隆原理是将T碱基通过磷酸键与拓扑异构酶第274位酪氨酸结合，载体与酶偶联。当连接PCR产物时，3`端羟基撞击磷酸键，断裂并发挥连接功能，连接反应为双分子作用过程，提高片段利用率。

EASY克隆具有连接速度快、操作简便、反应高效等优势。连接时间通常在30 min以内，适合较短DNA片段，连接效率高。

三、无缝克隆

无缝克隆利用同源重组方法进行连接，引物设计引入重叠序列，适用于连接单个或多个片段。实验过程简单快速，适合多片段拼接克隆。

无缝克隆方法对引物设计有要求，同源臂设计原则需遵循，载体线性化后，目的片段引物需与载体3`端对齐。引物设计可采用在线软件简化过程。

四、三种载体构建方法比较

T4连接酶介导的DNA克隆、EASY克隆、无缝克隆各有特点，原理和特点比较表列出了三种方法的差异。

五、克隆细节

1. 片段处理：PCR扩增后，根据产物情况选择直接连接、纯化再连接或胶回收后再连接载体。

2. 外源片段的准备：注意PCR设置，确保扩增片段完整，使用Taq系列DNA聚合酶时需加A反应；根据DNA聚合酶类型选择相应载体。

3. 克隆感受态细胞的选择：选择常用感受态细胞，了解其特点，便于实验。

4. 特殊DNA片段克隆：对于具有特殊结构的DNA片段，可通过调整连接条件或更换载体改善克隆效果。